정자에 콜레스테롤을 더하면 냉동·해동을 더 잘 견뎠을까요?

상세 설명

정자 세포막의 지질 조성을 바꾸면 수정능 획득과 첨체반응 능력뿐 아니라 동결보존에 대한 반응도 달라진다. 수소 정자를 동결하기 전에 콜레스테롤 담지 사이클로덱스트린(CLC)과 함께 배양하면, 대조군보다 동결·해동 후 운동성이 있는 세포와 생존 세포의 비율이 높아진다. 세포막의 콜레스테롤 양은 동결보존 중 막의 온전함을 유지하는 데 중요하며, CLC는 정자의 지질 조성을 바꾸어 동결보존 후 생존에 영향을 준다.

이 대조군을 둔 실험실 연구는 수퇘지 정자에 콜레스테롤을 첨가했을 때 동결보존 후 생존과 투명대 결합 능력이 어떻게 달라지는지 평가했다.

CLC를 만들기 위해 메탄올 2 mL에 녹인 메틸-β-사이클로덱스트린 1 g에 콜레스테롤 용액 0.45 mL(클로로포름 내 농도 200 mg mL–1)를 넣고 투명해질 때까지 저었다. 혼합물을 유리 접시에 붓고 질소 기체를 흘려 용매를 제거했다. 생성된 결정을 추가로 24시간 건조한 뒤 접시에서 꺼내 22°C의 유리 용기에 보관했다. 사용 용액은 37°C의 TALP 1 mL에 CLC 50 mg을 넣고 볼텍스 믹서로 짧게 혼합해 준비했다.

수퇘지 8마리 각각에서 사정액을 채취해 BTS®(Minitub, Brazil)로 1:1 희석하고 실온에서 2시간 유지했다. 이어 60분에 걸쳐 15°C로 냉각했다. 15°C에서 400 × g로 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고, 11% 유당 용액 80 mL와 난황 20 mL로 구성된 차가운 희석액에 정자 120 × 10⁶개를 재현탁했다.

정자는 두 처리군으로 나눴다. T1은 대조군, T2는 CLC 1.5 mg mL–1 처리군이었다. 시료를 15°C에서 15분간 배양한 뒤 90분에 걸쳐 5°C로 냉각하고, 11% 유당 용액 2.5 mL, 글리세롤 6 mL, Orvus-es-Paste 1.5 mL로 구성된 Freeze 희석액으로 1:1(v:v) 희석했다. 정자를 0.5 mL 프렌치 스트로에 넣고 액체질소 표면에서 4.5 cm 위의 정지된 액체질소 증기에서 20분간 동결한 다음, 액체질소에 담가 보관했다.

해동 후에는 표면형광현미경법(epifluorescence microscopy)으로 닭 난자의 난황주위막(EPM)과 돼지 난자 투명대(PZP)에 대한 정자의 결합을 평가했다. 해동 후 운동성과 염 용액에 보관한 EPM 및 PZP에 대한 결합 효율은 분산분석으로 분석했다.

CLC 처리군의 해동 후 운동성은 47%로 대조군의 34%보다 높았다(P < 0.05). 결합 정자 수도 CLC 처리군에서 EPM당 101개, PZP당 166개로, 대조군의 EPM당 77개, PZP당 65개보다 많았다(P < 0.05). 정자는 돼지 난자 투명대보다 EPM에서 더 쉽게 관찰할 수 있었다. 연구는 동결보존 전에 CLC를 첨가하면 동결보존 후 살아남는 수퇘지 정자 수가 증가한다고 결론지었다.

초록에는 브라질의 Fapemig, CNPq, CAPES가 명시되어 있다.